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在實驗中，我們通過輸卵管壁將2細胞期胚胎移植入代孕小鼠體內。與傳統(tǒng)胚胎移植的過程相比，更簡易，而且適合沒有經(jīng)驗的實驗操作員。

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回到小鼠生殖工程凍存及培養(yǎng)試劑

◆材料

1.　假孕第一天的雌性小鼠(這天觀察小鼠陰栓)

2.　微型彈簧剪刀（5mm刀片）

3.　鉗子（Pair of watchmaker's #5 forceps）

4.　動脈夾

5.　傷口縫合器(Autoclip 9mm; Clay Adams 427631) 和clip applicator (Mik-Ron Autoclip Applier; Clay Adams 427630)

→clip applicator

6.　塑料培養(yǎng)皿 (35mm X 10mm Cat.No.430588; CORNING)

7.　用于胚胎的移植和操作的玻璃微管

◆步驟

準備小鼠

1.　麻醉一只雌性小鼠。

2.　常規(guī)方法是取出卵巢、輸卵管及部分子宮。

3.　用動脈夾固定附著在卵巢囊上的脂肪

定位輸卵管

如下圖所示，通過切割輸卵管，往切口處插入微管，然后朝輸卵管的壺腹部注入胚胎。

但是，正如我們所看到的輸卵管的圖示(A)，小鼠的輸卵管呈細微而復雜的折疊式結構。而且，微管是從上方插入的，胚胎難以到達輸卵管的壺腹部。

為了簡化此過程，在操作前，可以通過動脈夾來改變輸卵管的定位，如圖(B)。

1. 立體顯微鏡下觀察輸卵管，并使用鉗子的尖端來確認輸卵管傘部和壺腹部的位置，或者改變動脈夾的位置。

2. 　通過改變動脈夾和小鼠的位置來定位輸卵管。

注意：因為每只小鼠的輸卵管折疊形狀都不一樣，需要仔細觀察和定位輸卵管才能更容易地進行實驗。 注意：如果你是左撇子，就能輕易地完成定位輸卵管的步驟。

胚胎與玻璃微管的制備

１. 在培養(yǎng)皿上制作一個200μL的 KSOM/AA滴液 (無液體石蠟)，然后在滴液里放入20個胚胎。

2. 制作轉移胚胎的玻璃微管，管內的空氣和溶液交替間隔2-3mm 。然后用玻璃微管吸入10個胚胎。

注意：如上圖所示，當玻璃微管首次插入滴液時，液體石蠟會殘留在滴液的表面。玻璃微管應從另一邊吸入胚胎，以免吸入液體石蠟。

有證據(jù)表明，如果輸卵管沾上液體石蠟會對胚胎發(fā)育造成不利的影響。

轉移胚胎

１. 使用Pair of watchmaker's #5 forceps和微型彈簧剪刀，解剖傘部和壺腹部之間的輸卵管壁。

2.　將含有胚胎的微管插入輸卵管的切口處，朝壺腹部注入胚胎。

3. 　用鉗子固定微管插入的輸卵管的位置。

4. 　排出胚胎和2~3個氣泡到壺腹部處。

注意：如果實驗進程順利，你可以通過壺腹部的壁看到氣泡。

　　注意：如果你無法將胚胎和氣泡排進輸卵管，稍微往后移動玻璃微管，再次嘗試。

5.　將切口處的微管移走。

注意：調整輸卵管的位置和方向后才能轉移胚胎。如果微管平行對齊輸卵管，就能更容易地插入輸卵管內。

6.　把卵巢、輸卵管和子宮放回小鼠的腹部，用傷口縫合器縫合傷口。

7.　重復上述步驟，把剩余的10個胚胎移植到另一只小鼠的輸卵管內。

8.　在37°C 加熱板上保持小鼠的體溫，直到小鼠蘇醒。

參考文獻

【1】 Nakagata N. 1992. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Exp. Anim. 41: 387-388.

【2】 Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse Embryo, A

Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-591-9.

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