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便捷的玻璃化冷凍保存小鼠胚胎

回到小鼠生殖工程學(xué)技術(shù)指南目錄

回到小鼠生殖工程凍存及培養(yǎng)試劑

◆材料

1.　1M DMSO(Cat. CSR-R-T072)

2.　DAP213(Cat.# CSR-R-T073)

3.　培養(yǎng)皿 (35mm X 10mm Cat.No.430588; CORNING)

4.　過濾裝置(Millex-GV 0.22μm Cat.No.SLGV013SL; MILLIPORE)

5.　灌注凝膠槍頭 (MBP Gel 200, Cat.No.3621; Molecular BioProducts)

6.　移液管

7.　凍存管(Cryogenic Vials Cat.No.MS-4501W; Sumitomo Bakelite, Japan is recommended. If you cannot get it, use 366656; NUNC.)

8.　微管

9.　凍存架

10.　Nalgene 冷卻器 (5115-0012; NALGENE, USA)

11.　液氮

12.　顯微鏡.

13.　0.25 M 蔗糖

14.　KSOM/AA

15.　液體石蠟

◆步驟

冷卻器和凍存管的準(zhǔn)備

1. 　使用前一天，把冷卻器放置-20°C 的冷藏庫(kù)里。

2. 　在實(shí)踐玻璃化步驟的前10分鐘，從冷藏庫(kù)里取出冷卻器。

3. 　凍存管放入冷卻器里 (5115-0012; NALGENE, USA)。 一只凍存管能裝大約40個(gè)胚胎，換而言之，當(dāng)你想裝120個(gè)胚胎時(shí)，你需要放3只凍存管在冷卻器里。

4. 　開始實(shí)驗(yàn)之前，請(qǐng)檢查凍存管內(nèi)的溫度是否為0°C 。

玻璃化

1. 　過濾1M DMSO后，在培養(yǎng)皿上滴入4個(gè)滴液（~100μL / 個(gè)）。其中一滴用于清洗從培養(yǎng)基里采集的胚胎，其余三個(gè)用于存放已清洗的胚胎。

2. 　把全部胚胎放入其中一個(gè)滴液里，清洗沾有培養(yǎng)基的胚胎。清洗后的胚胎平均放進(jìn)其余的3個(gè)滴液里。這3個(gè)等份的胚胎最終將會(huì)轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)存小瓶里。

例如，采集了120個(gè)胚胎，分成3個(gè)等份，每一等份40個(gè)，這些胚胎首先會(huì)一起放到清洗的滴液里，然后再分成3份放進(jìn)3個(gè)滴液里。

3.　使用20μL移液管和灌注凝膠槍頭 , 轉(zhuǎn)移5μL 的1M DMSO溶液的胚胎至凍存管內(nèi)。轉(zhuǎn)移后，立即將凍存管放置0°C 冷卻器內(nèi)5分鐘。

注意:凍存管可以放在0°C 冷卻器中超過5分鐘 (<20分鐘)。

注意:如果胚胎都集中在滴液的中央，就能把全部胚胎輕易地吸進(jìn)5μL 的M DMSO 溶液中。

4.　在0°C 下，往凍存管里加入45μL 的凍存液(DAP213) ，并在在0°C冷卻器里靜置5分鐘。

注意:加入DAP213凍存液后，不要把低溫管的塞子擰得太緊，否則胚胎復(fù)蘇后很難快速轉(zhuǎn)移。

5.　迅速將凍存管放到凍存架上，然后直接放進(jìn)液氮里。

參考文獻(xiàn)

【1】 Nakagata N. 1989. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. J. Reprod. Fert. 87: 479-483.

【2】 Nakagata N. 1993. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro

fertilization between cryopreserved gametes. J. Reprod. Fert. 99: 77-80.

【3】 Nakagata N. 1995. Studies on cryopreservation of embryos and gametes in mice. Exp. Anim. 44: 1-8.

【4】 Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse

embryos by simple vitrification. Exp. Anim. 46: 231-234. 118.

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