BL21(DE3)感受態(tài)細胞-重組克隆表達-分子生物學
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| 英文名稱 | E.coli BL21(DE3) Competent Cells |
|---|---|
| 儲存條件 | -70℃保存，運輸為干冰包裝。自收貨之日起液氮保存至少一年，-70℃保存至少6個月。 |
| 外觀（性狀） | 干冰運輸，單加10kg干冰費 |
| 單位 | 袋 |
本公司生產的BL21（DE3）感受態(tài)細胞是采用大腸桿菌BL21（DE3）菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細胞，可用于DNA的化學轉化。使用pUC19質粒檢測，轉化效率可達107，-70℃保存6個月轉化效率不改變。
基因型：F_ ompT hsdSB（rB_mB_）dcm gal（DE3）
特 點：該菌株用于高效表達克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達載體（如pET系列）的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ 噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合表達非毒性蛋白。
操作方法：（以下各步驟均為無菌操作）
1、將感受態(tài)細胞置于冰上融化，以下實驗以100ul感受態(tài)細胞為例。
2、向感受態(tài)細胞懸液中加入需轉化的目的DNA，注意目的DNA的體積不要超過感受態(tài)細胞懸液體積的十分之一，輕輕旋轉離心管以混勻內容物，冰浴放置30分鐘。
3、將離心管置于42℃水浴中放置60-90秒，然后快速轉移到冰浴中放置2-3分鐘，注意不要搖動離心管。
4、向離心管中加入500ul無菌無抗的SOC或LB培養(yǎng)基，37℃180rpm振蕩培養(yǎng)1小時。目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。
5、取適量已轉化的感受態(tài)細胞涂布含相應抗生素的SOC或LB平板，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時。涂布用量可根據(jù)具體實驗來調整，如轉化的DNA總量較多，可取100ul左右的轉化產物涂板；反之，如轉化的DNA總量較少，可取200-300ul的轉化產物涂板。過多菌液可以抑制細菌生長。如果預計的克隆較少，可通過離心后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。涂布剩余的菌液可4℃保存，如果次日的轉化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的平板。
注意事項：
1、感受態(tài)細胞應保存在-70℃，不可反復凍融，否則其轉化效率將會降低。
2、實驗過程中應嚴格無菌操作，防止其它DNA或雜菌的污染，避免為以后的篩選、鑒定帶來影響。
3、轉化時，轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源DNA量過多或體積過大反而會降低轉化效率。轉化時DNA體積要小于感受態(tài)細胞體積的十分之一。
4、轉化率的計算：轉化率＝產生菌落的總數(shù)/鋪板DNA總量。5、為防止轉化實驗不成功，可以保留部分連接產物，以重新轉化，將損失降到最低。
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