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　　宿主細(xì)胞DNA(Host Cell Proteins)對(duì)于具有商業(yè)規(guī)模的生物藥品中，治療性蛋白藥物在細(xì)胞培養(yǎng)中的表達(dá)是一種比較便宜有效的方法。但是這些產(chǎn)品在生產(chǎn)和純化過(guò)程中，很容易引起宿主細(xì)胞DNA殘余污染。盡管殘余宿主細(xì)胞DNA對(duì)治療性蛋白藥物的影響在很大程度上還是未知的，但是也有研究表明宿主細(xì)胞DNA可能包含一些有害的DNA片段，使其具有傳染性和致瘤性。因此，在生物制藥中，對(duì)宿主細(xì)胞DNA的檢測(cè)是非常有必要的。 Wako（日本和光純藥）對(duì)于生物制藥中的宿主細(xì)胞DNA殘留，可提供以下試劑： DNA Extractor^? Kit

295-50201 50tests

特點(diǎn)

可與Threshold系統(tǒng)配合使用進(jìn)行 能用于生物制藥、血清中的DNA提取 單獨(dú)的離心管無(wú)交叉污染，提取的核酸可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn) 可獲得高質(zhì)量高回收率的DNA 使用的方法為碘化鈉法（Sodium Iodide Method），比傳統(tǒng)的方法更為環(huán)保 高靈敏度，可提取低至10pg的DNA

◆DNA Extractor^? Kit實(shí)驗(yàn)方案

方案1：血清中DNA提取操作步驟

試劑準(zhǔn)備：

1） DNA提取之前，試劑提取如下：

26mL碘化鈉溶液加入6mL蒸餾去離子水稀釋?zhuān)?/p>

再加入1mL月桂酰肌氨酸鈉和65μL糖原溶液并混合均勻。

2） 向洗滌溶液（B）加入2μL糖原溶液并立即混合均勻。

注意事項(xiàng)：

1）用于稀釋Nal溶液的蒸餾去離子水須去除DNA。

2）配制好的洗滌溶液（B）在 4℃至少能保存一周。如果需要少量的洗滌溶液（B），加入糖原 溶液到無(wú)菌離心管中至

　 合適體積即可。

3）在保存期間Nal溶液會(huì)結(jié)晶，加熱溶液至50℃可幫助溶解。 DNA提取步驟：

1）吸取100μL的血清樣品加入1.5mL微量離心管；

2）再加入300μL配制好的Nal溶液至離心管并混合均勻；

3）將離心管在60℃恒溫容器中加熱15分鐘；

4）取出離心管，加入400μL異丙醇至離心管并混合均勻；

5）離心管在室溫靜置15分鐘后離心10,000g 15分鐘；

6）盡可能多地吸取上清液，將離心管倒置在紙面上除去殘留溶液；

7）加入1mL配制好的洗滌溶液（B）重懸浮得到的白色沉淀，并使白色沉淀從離心管壁上彈開(kāi)；

8）短暫離心10,000g 5min，去除上清液，將剩余沉淀真空干燥，用于后續(xù)的DNA分析。

方案 2: Threshold* 系統(tǒng)DNA定量法的預(yù)處理

試劑預(yù)處理 :

1） 將65μL糖原溶液加入26mL碘化鈉溶液；

2） 將2μL糖原溶液加入40mL洗滌溶液（B），立即混合均勻。

注意事項(xiàng)：

1） 用于稀釋碘化鈉溶液的蒸餾去離子水須去除DNA。

2） 配制好的洗滌溶液（B）在 4℃至少能保存一周。如果需要少量的洗滌溶液（B），加入糖原溶液到無(wú)

　 菌離心管中至合適體積即可。

3） 在保存期間碘化鈉溶液會(huì)結(jié)晶，加熱溶液至50℃可幫助溶解。

4） 提取步驟應(yīng)在DNA變性之前，因此重要的是使用無(wú)菌技術(shù)盡可能降低DNA污染。預(yù)先包裝好的無(wú)

　 菌吸管、無(wú)菌試管和手套都要經(jīng)過(guò)此步驟。

DNA提取步驟：

1） 吸取400μL或500μL的樣品加入2mL無(wú)菌帶蓋微量離心管并混合均勻；

2） 吸取20μL的月桂酰肌氨酸鈉溶液加入微量離心管并混合均勻；

3） 再加入500μL包含糖原的碘化鈉溶液至混合溶液，渦旋后在40℃保溫15分鐘；

4） 加入900μL異丙醇至混合溶液，渦旋后靜置于室溫15分鐘；

5） 短暫離心10,000g 15min后，能看見(jiàn)管壁有白色沉淀，吸取上清液后將離心管倒置于紙面去

　 除殘留溶液；

6） 加入800μL 洗滌溶液（A）至離心管，劇烈渦旋使白色沉淀從離心管壁上彈開(kāi)；

7） 短暫離心10,000g 5min后，去除殘留溶液；

8） 加入1500μL包含糖原的洗滌溶液（B）至離心管并渦旋，短暫離心10,000g 5min后吸取上清液，

　 剩余的白色沉淀包括DNA和糖原載體；

9） 加入分析用緩沖液 (Zero Calibrator buffer) 使白色沉淀溶解，用于后續(xù)的DNA分析。

注意事項(xiàng)：

請(qǐng)于各步驟使用攪拌器將溶液攪拌均勻。樣品溶液里含有DNA酶時(shí)，進(jìn)行步驟2之前請(qǐng)先進(jìn) 行步驟3。步驟4里樣品溶解不完全時(shí)，請(qǐng)把保溫溫度升至40-60℃幫助溶解。但是含有部分蛋白（γ- 球蛋白）或高濃度蛋白的樣品（＞50mg/mL），加熱可能會(huì)導(dǎo)致蛋白聚集，請(qǐng)注意。

* 為Molecμlar Devices公司注冊(cè)商標(biāo)，是使用生物傳感器的高靈敏度分析裝置。

參考文獻(xiàn)

1. Ishizawa, M., Kobayashi, Y., Miyamura, T. and Matuura,: Simple Procedure of DNA isolation from human seru

Nucleic Acids Res., 19, 5792 (1991)

相關(guān)資料：

DNA Extractor^? Kit

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