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qiagen205311QuantiTect Rev. Transcription Kit

cDNA合成和gDNA去除僅用20分鐘完成有效去除基因組DNA，無需設(shè)計(jì)RNA特異性引物或探針高特異性，即便是低豐度的轉(zhuǎn)錄本也能獲得高產(chǎn)量的cDNA轉(zhuǎn)錄本的5' 和3' 端區(qū)域都可以進(jìn)行cDNA 合成

For 50 x 20 ul reactions: 100 ul 7x gDNA Wipeout Buffer, 50 ul Quantiscript Reverse Transcriptase, 200 ul 5x Quantiscript RT Buffer, 50 ul RT Primer Mix, 1.9 ml RNase-Free Water

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒組分確保高效、高靈敏的Real-Time RT-PCR

組分	優(yōu)點(diǎn)
gDNA Wipeout Buffer	僅在real-time RT-PCR 中檢測(cè)RNA
Quantiscript Reverse Transcriptase	可用于廣泛RNA起始量（10 pg to 1 µg RNA），高特異性
Quantiscript RT Buffer	可通讀困難模板
RT Primer Mix	所有轉(zhuǎn)錄本區(qū)域合成cDNA, 甚至從5' 端區(qū)域

qiagen205311QuantiTect Rev. Transcription Kit原理

為獲得準(zhǔn)確的real-time RT-PCR基因表達(dá)分析結(jié)果，很重要的是僅擴(kuò)增和檢測(cè)cDNA。基因組DNA的干擾可通過設(shè)計(jì)橫跨外顯子/外顯子邊界的引物或探針避免。盡管如此，在某些特殊情況下（如：cDNA來自一個(gè)單外顯子基因），起始RNA樣品必須無基因組DNA。

使用QuantiTect Reverse Transcription Kit，基因組DNA污染物可使用*的gDNA去除緩沖液迅速有效的去除（見圖：“高效去除基因組DNA，確保精確的Real-Time RT-PCR”）。因?yàn)榧兓疪NA樣品后無需另外采用DNA酶消化，從而可節(jié)省時(shí)間和費(fèi)用。并且也無需設(shè)計(jì)RNA特異性引物和探針。

低豐度轉(zhuǎn)錄本獲得更高產(chǎn)量的cDNA

	CT values for IL12A （low expression）		CT values for IL1RN （higher expression）
Input RNA （ng）	QIAGEN	Supplier AII	QIAGEN	Supplier AII
1000	30.9	32.0	23.1	24.9
100	34.2	35.4	26.3	26.6
10	37.8	46.8	29.7	30.3
1	N.D.	N.D.	32.4	34.5

應(yīng)用Real-time，兩步法RT-PCR 分析IL12A 和IL1RN，起始RNA量不同 。應(yīng)用QuantiTect Reverse Transcription Kit 或來自供應(yīng)商Supplier A_II的試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總 RNA 。在 ABI PRISM 7900 上應(yīng)用的QuantiTect Probe PCR Kit 、IL12A或 IL1RN的 QuantiTect Gene Expression Assays 分析合成的。 應(yīng)用凱杰試劑盒C_T值較低，尤其中等豐度的基因IL12A（粗體），cDNA產(chǎn)量更高。N.D.：未檢測(cè)（Not detected）。

RT Primer Mix包含有特別優(yōu)化的oligo-dT和隨機(jī)引物的混合物，使cDNA合成可從RNA轉(zhuǎn)錄本的各個(gè)區(qū)域起始，甚至可從5'區(qū)域開始（見圖：“高靈敏度檢測(cè)12.5 kb 轉(zhuǎn)錄本5'區(qū)域的靶分子”）。相對(duì)于其他供應(yīng)商提供的試劑盒來說，QuantiTect Reverse Transcription Kit為real-time PCR分析提供高產(chǎn)量的cDNA，無需考慮待擴(kuò)增目標(biāo)序列位于轉(zhuǎn)錄本的哪個(gè)區(qū)域。同時(shí)，QuantiTect Reverse Transcription Kit也確保了real-time RT-PCR結(jié)果更好的重復(fù)性。

操作流程

使用QuantiTect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒可在20分鐘內(nèi)去除基因組DNA和合成cDNA（見流程圖）。由于兩個(gè)反應(yīng)均在同一孵育溫度并使用預(yù)混液構(gòu)建反應(yīng)，因此操作過程快速且方便。相反，供應(yīng)商I提供的試劑盒操作需更多移液步驟且經(jīng)常需要調(diào)整孵育溫度，因此需要更長時(shí)間和更多手動(dòng)操作。

應(yīng)用

QuantiTect Reverse Transcription Kit可從各種類型的起始樣品中合成cDNA以實(shí)現(xiàn)高效和高靈敏度的real-time RT-PCR，包括激光顯微切割樣品和活組織切片樣品。與其他供應(yīng)商提供的試劑相比，QuantiTect Reverse Transcription Kit在檢測(cè)低豐度基因時(shí)具有更高的靈敏度（見圖：“Real-Time，兩步法RT-PCR精確度更高”）。

為獲得高特異性和高靈敏度的real-time RT-PCR結(jié)果，又避免耗時(shí)的反應(yīng)步驟優(yōu)化過程，我們推薦QuantiTect Reverse Transcription Kit和其他QuantiTect產(chǎn)品聯(lián)合使用。包括經(jīng)優(yōu)化的PCR反應(yīng)預(yù)混液和即用型引物，使用SYBR Green染料法或序列特異性探針法進(jìn)行 real-time RT-PCR。

Images

高效去除基因組DNA，確保精確的Real-Time RT-PCR — A 高靈敏度檢測(cè)12.5 kb轉(zhuǎn)錄本5'區(qū)域的靶分子 快速方便的cDNA合成 高靈敏度的Real-Time，兩步法RT-PCR

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