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本試劑盒是通過細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B，在低滲透壓條件下，使細(xì)胞充分膨脹，然后破壞細(xì)胞膜，釋放出細(xì)胞漿蛋白，然后通過離心得到細(xì)胞核沉淀。zui后通過高鹽的細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提得到細(xì)胞核蛋白。

本試劑盒可以抽提50個(gè)樣品，如果每個(gè)樣品的數(shù)量為約二百萬細(xì)胞或約60毫克組織。

包裝清單：

使用說明：

1. 準(zhǔn)備溶液：溫融解試劑盒中的三種試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽

提試劑A備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。取適當(dāng)量的細(xì)胞核蛋白抽提試

劑備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。

2. 對于貼壁細(xì)胞：用PBS洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，或用EDTA溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，

并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，盡zui大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶

消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

3. 對于懸浮細(xì)胞：用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡zui大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。

4. 每20微升細(xì)胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A。（對于二百萬Hela細(xì)胞，其細(xì)胞

沉淀的體積大約為20微升或40毫克。）

5. zui高速劇烈Vortex 5秒，把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開。（如果細(xì)胞沉淀沒有*懸浮并分散開，可

以適當(dāng)延長vortex時(shí)間。）

6. 冰浴10-15分鐘。

7. 加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B 10微升。zui高速劇烈Vortex 5秒，冰浴1分鐘。

8. zui高速劇烈Vortex 5秒，4℃ 12,000-16,000g離心5分鐘。

9. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白。可以立即使用，也可以凍存。（千

萬不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。）

10. 對于沉淀，*吸盡殘余的上清，加入50微升添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑。（不吸盡上清會

帶來細(xì)胞漿蛋白的污染。）

11. zui高速劇烈Vortex 15-30秒，把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速

劇烈Vortex 15-30秒，共30分鐘。

12. 4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。

13. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃凍

存。

14. 對于新鮮組織：

A. 把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片。按照20:1的比例混合適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B（例

如200微升細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B）。并加入PMSF至zui終濃度為1mM配制成

組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液，并在玻璃

勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進(jìn)行。

B. 勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，冰浴放置15分鐘。

C. 4℃ 1,500g離心5分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的塑料管中，為抽提得到的部分細(xì)胞漿蛋白。（吸上

清時(shí)千萬不要觸及沉淀。）

D. 對于沉淀，到了這一步已經(jīng)充分勻漿，但很多細(xì)胞還沒有破碎。接下去按照使用說明的步驟4開

始操作，即把沉淀當(dāng)做已經(jīng)離心收集好的細(xì)胞沉淀操作，按照步驟4至步驟13抽提得到細(xì)胞漿蛋

白和細(xì)胞核蛋白。抽提得到的細(xì)胞漿蛋白可以和步驟14C中抽提得到的細(xì)胞漿蛋白合并。

保存條件：

-20℃保存，一年有效。

注意事項(xiàng)：

需自備PMSF。PMSF一定要在抽提試劑加入到樣品中前2-3分鐘內(nèi)加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。PMSF（ST506）可以向碧云天訂購。

抽提蛋白的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。

本試劑盒對于組織樣品，僅適合于新鮮組織，對凍存過的組織抽提效果很差。可以抽提的組織樣品數(shù)通常不足100個(gè)。

使用本試劑盒抽提到的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白均可直接用BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S）測定蛋白濃度。但不適合用Bradford法測定蛋白濃度。

為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。