Fura2-AM試劑貨號：F015
1-[6-Amino-2-(5-carboxy-2-oxazolyl)-5-benzofuranyloxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, pentaacetoxymethyl ester
CAS號：108964-32-5
商品信息
儲存條件：-20度保存
運(yùn)輸條件：室溫
分子式：
C44H47N3O24
分子量：
1001.85
特點(diǎn)：
● 雙波長激發(fā)檢測鈣離子
●激光共聚焦，流式細(xì)胞儀均可檢測
●熒光強(qiáng)度高
選擇規(guī)格：
1mg
產(chǎn)品性狀
| 規(guī)格
性狀： 本產(chǎn)品為黃色或橙黃色粉末，使用時將固體溶解于無水DMSO中
純度（HPLC）: 98%以上
熒光光譜圖： 符合實驗要求
NMR光譜圖： 符合實驗要求
處理條件
保存方法 ： 避光冷凍 |
產(chǎn)品概述
Fura 2-AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料。Fura 2-AM的熒光比較弱，最大激發(fā)波長為369 nm，最大發(fā)射波長為478 nm，并且其熒光不會隨鈣離子濃度改變而改變。Fura 2-AM進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fura 2，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fura 2和鈣離子結(jié)合后，最大激發(fā)波長為335 nm(最大激發(fā)波長隨離子濃度的的不同而有所不同)，最大發(fā)射波長為505nm。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為510 nm。如果做雙波長檢測，則推薦使用的激發(fā)波長為340 nm和380 nm。
原理
Fura 2可以和鈣離子(Ca2+)結(jié)合，結(jié)合鈣離子后在330-350 nm激發(fā)光下可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，而在380 nm激發(fā)光下則會導(dǎo)致熒光減弱。這樣就可以使用340 nm和380 nm這兩個熒光的比值來檢測細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，可以消除不同細(xì)胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，熒光探針的滲漏，細(xì)胞厚度差異等一些誤差因素。
激發(fā)發(fā)射波長
Ex ：340～380 nm
Em ：510 nm
操作步驟
1、用HBSS溶液稀釋1-5 mmol/l的Fura 2-AM母液，配制成1-5 μmol/l的Fura 2-AM工作液。
（此濃度僅供參考，請根據(jù)具體實驗要求自行調(diào)整）
例如:1 mmol/l母液配制1 ml濃度為5 μmol/l工作液的方法：用1 ml HBSS溶液稀釋5 μl母液即可。
如果Fura 2-AM進(jìn)入細(xì)胞效果不好，可使用Pluronic?F-127后者可以防止Fura 2-AM在緩沖液里聚合
并能促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞。
*Pluronic?F-127先用DMSO溶解至濃度為20%（W/V），然后根據(jù)實驗需要直接加入Fura 2-AM工作液中
至終濃度為0.04-0.05%（此濃度僅供參考，請根據(jù)具體實驗要求自行調(diào)整）。
2、取出預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，使用HBSS溶液洗滌細(xì)胞3次。
如果使用含血清的培養(yǎng)基，血清中的酯酶會分解AM體,從而降低Fura 2-AM進(jìn)入細(xì)胞的效果。
另外含有酚紅的培養(yǎng) 基會使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養(yǎng)基殘留。
3、加入Fura 2-AM工作液，溶液量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。
4、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育10-60分鐘，除去Fura 2-AM工作液。關(guān)于孵育的時間，
如果首次做實驗不能確定，建議先孵育30分鐘，看熒光效果:如果細(xì)胞死亡較多，縮短時間；
熒光強(qiáng)度太弱，延長時間。
5、用HBSS溶液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除殘留的Fura 2-AM工作液。然后加入HBSS溶液覆蓋細(xì)胞。
6、37℃培養(yǎng)箱孵育約20-30分鐘，以確保AM體在細(xì)胞內(nèi)的完全去酯化作用。如果細(xì)胞內(nèi)酯酶活性較低，
建議嚴(yán)格按照此操作進(jìn)行；酯酶活性高的細(xì)胞實驗，可以忽略此步。
7、用流式細(xì)胞儀或其它設(shè)備檢測細(xì)胞，激發(fā)波長380 nm（Fura 2）和340 nm（鈣離子-Fura 2)
發(fā)射波長510 nm。
注意事項
1、試劑容易吸潮，從冰箱取出后，請確認(rèn)在干燥的環(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑極其微量，
開封前，請輕彈管壁幾次，以保證粉末落入管底。
2、第一次使用時, 建議母液即配即用。試劑溶解后盡可能在短時間內(nèi)使用，以保證實驗效果。
3、溶解液DMSO需要保證新鮮無水，否則將會導(dǎo)致AM體水解，使熒光染料無法進(jìn)入細(xì)胞，影響實驗效果。
4、母液遇水極易分解，如果不能一次用完，建議分裝保存，例如分裝成5 μl/管，用封口膜封口，
并用鋁箔紙包裹，放在一個密閉性能好的塑料袋中，并放入一包干燥劑，在≤-20℃密封避光保存。
5、建議您在正式實驗前先摸索一下細(xì)胞量、鈣離子熒光探針的終濃度、培養(yǎng)時間等，找到最佳實驗條件
數(shù)據(jù)處理
Fλ1與Fλ2分別是λ1與λ2激發(fā)時的總熒光強(qiáng)度，Sf 1與Sf 2是兩種紫外光激發(fā)時游離Fura-2 (未結(jié)合Ca2+)的熒光系數(shù)，
Cf是游離的Fura-2濃度，Sb1與Sb2是相應(yīng)波長下結(jié)合Ca2+后Fura-2的熒光系數(shù)，Cb是結(jié)合Ca2+的Fura-2濃度
參考文獻(xiàn)
1) G. Grynkiewicz, M. Poenie and R. Y. Tsien, “A New Generation of Ca2+ Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties”, J. Biol. Chem., 1985, 260, 3440.
2) D. A. Williams, K. E. Fogarty, R. Y. Tsien and F. S. Fay, “Calcium Gradients in Single Smooth Muscle Cells Revealed by the Digital Imaging Microscope Using Fura-2”, Nature, 1985, 318, 558.
3) R. Y. Tsien, T. J. Rink and M. Poenie, “Measurement of Cytosolic Free Ca2+ in Individual Small Cells Using Fluorescence Microscopy with Dual Excitation Wavelengths”, Cell Calcium, 1985, 6, 145.
4) D. A. Williams and F. S. Fay, “Intracellular Calibration of the Fluorescent Calcium Indicator Fura-2”, Cell Calcium, 1990, 11, 75.
5) W. Almers and E. Neher, “The Ca Signal from Fura-2 Loaded Mast Cells Depends Strongly on the Method of Dye-loading”, FEBS Lett., 1985, 192, 13.
6) G. H. R. Rao, J. D. Peller and J. G. White, “Measurement of Ionized Calcium in Blood Platelets with a New Generation Calcium Indicator”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1985, 132, 652.
7) H. Ozaki, K. Sato, T. Satoh and H. Karaki, “Simultaneous Recordings of Calcium Signals and Mechanical Activity Using Fluorescent Dye Fura 2 in Isolated Strips of Vascular Smooth Muscle”, Jpn. J. Pharmacol., 1987, 45, 429.
8) M. Mitsui, A. Abe, M. Tajimi and H. Karaki, “Leakage of the Fluorescent Ca2+ Indicator Fura-2 in Smooth Muscle”, Jpn. J. Pharmacol., 1993, 61, 165.
Q&A
| Q1:細(xì)胞內(nèi)檢測鈣離子的試劑種類都有什么，選擇什么樣的比較好呢？ |
| A1: 根據(jù)檢測儀器和檢測波長有很多的選擇，產(chǎn)品后面標(biāo)有AM的試劑是可以通過細(xì)胞膜的
有很多種相似的試劑，其特點(diǎn)如下：
【Fura 2】
?雙波長激發(fā)
激發(fā)(λex= Ca:340 nm, Ca free:380 nm)、發(fā)射：λem=500 nm
?解離常數(shù)：224 nmol/L
?因為是熒光強(qiáng)度的比值、可以有效的減小誤差
=>細(xì)胞內(nèi)Ca濃度計算。
?該試劑被使用的最多
?必須要更換過濾片、會耽誤一些時間。
【Fluo 3】
?單波長激發(fā)
激發(fā)：λex=508 nm、發(fā)射：λem=527 nm
?解離常數(shù)：400 nmol/L
?因為激發(fā)光在長波段，所以對細(xì)胞的損傷比較小
（不會受到NADH、NADPH的影響）
?可以使用Ar激光激發(fā)裝置。
?不適合切片中鈣離子的檢測
?【Fluo 4】
?單波長激發(fā)
?激發(fā)：λex=495 nm、發(fā)射：λem=518 nm
?解離常數(shù)：360 nmol/L
?與Fluo3相比對熒光強(qiáng)度更高。
?因為激發(fā)光在長波段，所以對細(xì)胞的損傷比較小
?（不會受到NADH、NADPH的影響）
?可以使用Ar激光激發(fā)裝置。 ?與Fluo3相比對細(xì)胞的毒性低
?【Indo 1】
?單波長激發(fā)
?激發(fā)：λex= 330 nm、發(fā)射(λem= Ca:410 nm, Ca free:485 nm)
?解離常數(shù)：250 nmol/L
?由于不需要更換濾光片，可以很快地檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化以及像心肌細(xì)胞運(yùn)動中鈣離子的變化
?（需要兩臺檢測儀器）
?【Rhod 2】
?單波長激發(fā)
?激發(fā)：λex=553 nm、發(fā)射：λem=576 nm
?解離常數(shù)：1.0 μmol/L
?因為激發(fā)光在長波段，所以對細(xì)胞的損傷比較小
?（不會受到NADH、NADPH的影響）
?可以使用Ar激光激發(fā)裝置。
?【Quin 2】
?單波長激發(fā)
?激發(fā)：λex=339 nm、發(fā)射：λem=492 nm
?解離常數(shù)：110 nmol/L
?最早開發(fā)的產(chǎn)品 |
?
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