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Cellstain- CFSE試劑貨號：C375 5- or 6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)fluorescein 3′,6′-diacetate CAS號：150347-59-4 商品信息 儲存條件：-20度保存 運輸條件：室溫 分子式：

C₂₉H₁₉NO₁₁

分子量：

557.46

特點：

● 可用于細(xì)胞增殖檢測

● 長效熒光染色，最長三周可見

● 可用于流式細(xì)胞儀檢測

選擇規(guī)格： 1mg

湊單關(guān)聯(lián)產(chǎn)品TOP5

NO.1. Annexin V, FITC Apoptosis Detection Kit細(xì)胞凋亡檢測

NO.2. Annexin V, 633 Apoptosis Detection Kit細(xì)胞凋亡檢測

NO.3. Calcein-AM細(xì)胞質(zhì)染色

NO.4. Cell Viability Assay Kit細(xì)胞增殖/毒性檢測

NO.5. FerroOrange細(xì)胞亞鐵離子檢測

規(guī)格性狀

規(guī)格

特性：該產(chǎn)物為無色至微黃色固體，可溶于二甲基亞砜和乙腈。

可溶于二甲基亞砜：試驗成功

NMR光譜：試驗成功

產(chǎn)品概述

熒光染料 CFSE(CFDA-SE)，是一種可對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的新型染料，可以標(biāo)記活體細(xì)胞。其基本原理如下：CFSE 是一種帶有琥珀酰亞胺(NHS)的熒光染料，可以結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。CFSE在結(jié)構(gòu)上將酚羥基部位改造成 AM 體，所以自身不發(fā)熒光，熒光背景低，脂溶性高，能夠輕易穿透細(xì)胞膜，在活細(xì)胞內(nèi)與胞內(nèi)蛋白共價結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 CFSE 的 AM 部位能被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解發(fā)出綠色熒光。CFSE 的琥珀酰亞胺(NHS)和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基部位結(jié)合，固定在細(xì)胞內(nèi)，不會漏出細(xì)胞外。CFSE 進(jìn)入細(xì)胞后定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，在細(xì)胞核的熒光最強。

在細(xì)胞分裂增殖過程中，CFSE 的熒光強度會隨著細(xì)胞的分裂而逐級遞減，標(biāo)記熒光可平均分配至兩個子代細(xì)胞中，因此其熒光強度是親代細(xì)胞的一半，根據(jù)這一特性，它可被用于檢測細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期的估算及細(xì)胞分裂等方面。另外，CFSE 標(biāo)記的細(xì)胞用于體內(nèi)觀察可以長達(dá)數(shù)周之久，它常被用來做活體細(xì)胞檢測實驗和用熒光電鏡觀察細(xì)胞長期活動的實驗。有報道證實 CFSE 毒性小，不影響細(xì)胞的增殖能力。此方法操作簡單，且不用放射性同位素，不存在安全隱患。可以更快速，更準(zhǔn)確和更安全地得到想要的實驗數(shù)據(jù)。

原理

熒光特性

熒光波長：λex=496 nm, λem=516 nm

操作說明

＊建議您在正式實驗前先摸索一下細(xì)胞量、CFSE的終濃度、培養(yǎng)時間等，找到最佳實驗條件。

配制試劑：

1、從冰箱中取出CFSE試劑，放至室溫后再打開。盛放CFSE的管子開蓋前請輕彈管壁幾次，讓粉末充分落入管底，必要時可采用離心的方法。

2、取0.9 ml DMSO^a)加到CFSE管中溶解，配制成2 mM的CFSE母液^b)（加入DMSO后請先蓋上蓋子，反復(fù)顛倒把蓋子和管壁上的試劑洗到底部，并用移液器反復(fù)吹打使溶解完全）。

3、用PBS(-)或適當(dāng)?shù)木彌_液將其稀釋成100 μM或其它濃度（如果采用載玻片觀察法，建議濃度為20 μM的工作液^c))。

a) DMSO需要保證新鮮無水，否則將會導(dǎo)致AM體水解，使熒光染料無法進(jìn)入細(xì)胞，影響實驗效果。

b) 由于CFSE母液遇水極易分解，所以建議分裝保存，例如分裝成5 μl/管。

方法：分裝后用封口膜密封管口，再用錫箔紙包裹，最后和干燥劑一起用塑料袋密封，≦-20℃冷凍保存。

c) CFSE工作液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，因為CFSE吸水會分解，影響染色效果。

* PBS(-)：不含鈣和鎂離子的PBS。

細(xì)胞染色(僅供參考)：

例1 培養(yǎng)板觀察法

1、準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，用PBS(-)等合適的培養(yǎng)基^a)調(diào)整細(xì)胞濃度至約10⁷個／ml。

2、取1ml細(xì)胞懸液至試管中，加入適量CFSE工作液，輕輕攪拌混勻（建議CFSE的終濃度參考相關(guān)論文或做個預(yù)實驗：分別設(shè)定終濃度為0.5,1,2,5,10,20 μM…,以確定最佳染色濃度^b)）。

3、在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15-30分鐘。

4、離心后去上清，加入2 ml PBS溶液，再離心后去上清，重復(fù)此操作一次。

5、加入合適的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。

6、取500 μl的細(xì)胞懸液加在培養(yǎng)孔中，用熒光顯微鏡觀察，看到熒光后，根據(jù)自己實驗的要求調(diào)整細(xì)胞數(shù)量^c)進(jìn)行實驗。

例2載玻片觀察法

1、準(zhǔn)備1 ml細(xì)胞懸液，用PBS(-)等合適的培養(yǎng)基^a)調(diào)整細(xì)胞濃度至約10⁷個／ml。

2、取30 μl細(xì)胞懸液至試管中，加入10 μl濃度為20 μM的CFSE工作液（終濃度為5μM），輕輕攪拌混勻^b)。

3、在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15-30分鐘。

4、滴10 μl的細(xì)胞懸液在載玻片上，用熒光顯微鏡觀察，看到熒光后，根據(jù)自己實驗的要求調(diào)整細(xì)胞數(shù)量^C)進(jìn)行實驗。

＊如果背景高的話，第3步之后需要洗去多余的CFSE：

離心后去上清，加入90 μl PBS溶液，再離心后去上清，重復(fù)此操作一次。

a)盡可能用不含血清的培養(yǎng)基，血清中的酶和蛋白質(zhì)會分解CFSE，可能會影響染色效果。

b)如果熒光強度弱，可以適當(dāng)提高CFSE的終濃度。如果細(xì)胞毒性大或背景太高，可以適當(dāng)降低CFSE的終濃度，請摸索條件找到最佳濃度。

c)根據(jù)不同的實驗?zāi)康暮鸵螅捎孟♂尩姆椒ㄕ{(diào)整細(xì)胞數(shù)量。

文獻(xiàn)

1) M. Bronner-Fraser, “Alterations in Neural Crest Migration by a Monoclonal Antibody That Affects Cell Adhesion”,J. Cell Biol.,1985,101, 610.

2) A. Nose and M. Takeichi, “A Novel Cadherin Cell Adhesion Molecule:Its Expression Patterns Associated WithImplantation and Organogenesis of Mouse Embryos”,J. Cell Biol.,1986,103, 2649.

3) S. A. Weston and C. R. Parish, “New Fluorescent Dyes for Lymphocyte Migration Studies Analysis by Flow Cytometry and Fluorescent Microscopy”,J. Immunol. Methods,1990,133, 87.

4) C. K. Raymond, P. J. O’hara, G. Eichinger, J. H. Rothman and T. H. Stevens, “Molecular Analysis of the Yeast VPS3 Gene and the Role of Its Product in Vacuolar Protein Sorting and Vacuolar Segregation during the Cell Cycle”,J. Cell Biol.,1990,111, 877.

5) G. Radcliff, R. Waite, J. Lefevre, M. D. Poulik and D. M. Callewaert, “Quantification of Effector/Target Conjugation Involving Natural Killer(NK) or Lymphokine Activated Killer(LAK) Cells by Two-color Flow Cytometry”,J. Immunol. Methods,1991,139, 281.

6) S. A. Weston and C. R. Parish, “Calcein: a Novel Marker for Lymphocytes Which Enter Lymph Nodes”,Cytometry,1992,13, 739.

7) L. S. D. Clerck, C. H. Bridts, A. M. Mertens, M. M. Moens and W. J. Stevens, “Use of Fluorescent Dyes in the Determination of Adherence of Human Leucocytes to Endothelial Cells and the Effects of Fluorochromes on Cellular Function”,J. Immunol. Methods,1994,172, 115.

常見問題Q&A

Q1請告訴我如何使用CFSE。

A1：參考文獻(xiàn)[1]中的描述如下所示。 殺死7-10周大的CBA / H小鼠，去除脾臟（或其他目標(biāo)器官），然后浸入F15培養(yǎng)基（1％FCS）中。 然后，通過金屬網(wǎng)獲得細(xì)胞懸液，并通過離心除去紅細(xì)胞，死細(xì)胞等。 將純化的淋巴細(xì)胞懸浮在pH 7.0的PBS中至50,000,000細(xì)胞/ mL。 加入5.0μM濃度的CFSE，并在37°C下標(biāo)記15分鐘。懸浮在冰冷卻的F15培養(yǎng)基（1％FCS）中并離心 用（350g，5分鐘，20℃）洗滌兩次。懸浮在F15培養(yǎng)基中。 靜脈注射到CBA / H小鼠中。一定時間后，殺死鼠標(biāo)并去除脾臟（或其他目標(biāo)器官）。 切除淋巴細(xì)胞并分離并通過流式細(xì)胞儀分析。 參考文獻(xiàn)[2]是關(guān)于鈣黃綠素-AM的，但也通過與[1]相同的步驟將其與CFSE進(jìn)行了比較。 【參考文獻(xiàn)】 1. Susan A. Weston, Christopher R. Parish, J. Immunol. Methods, 133, 87 (1990). 2. Susan A. Weston, Christopher R. Parish, Cytometry, 13, 739 (1992).

Q2：細(xì)胞染料的激發(fā)波長和發(fā)射波長是多少。

A2：

Q3:細(xì)胞染色試劑Cellstain的哪些活細(xì)胞染色染料可以在細(xì)胞中長時間停留？

A3: “就細(xì)胞內(nèi)保留而言，“ CFSE”可以在細(xì)胞中停留最長時間。盡管熒光強度降低，但是已經(jīng)證實細(xì)胞中存在熒光染料達(dá)8周。用“ Calcein-AM”和“ BCECF-AM”觀察到熒光達(dá)3天。也有報道稱“鈣蛋白-AM”在6小時內(nèi)在細(xì)胞中保留了90％” ?S.A.Weston, et.al., J.Immunol.Methods, 133, 87-97(1990) ?H.P.Zhong, et.al., Hum.Immunol., 37, 264-270(1993)” 但是，“鈣調(diào)蛋白-AM”和“ BCECF-AM”對細(xì)胞毒活性沒有影響。 ?L.S.D.Clerck, et.al., J.Immunol.Methods, 172, 115-124(1994) 還要注意的一點是，原始的基本骨架是熒光素，因此由于激發(fā)光而褪色由于容易發(fā)生，因此可能難以通過長期激發(fā)來觀察熒光。 （盡管最好使用防褪色劑等）