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Bio-Rad微滴式數(shù)字PCR技術(shù)（ddPCR）是第三代PCR技術(shù)，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)參照物質(zhì)即可給出樣本的拷貝數(shù)濃度而非Ct值，其檢測(cè)結(jié)果為判讀提供量化的依據(jù)。根據(jù)LOB(limit of blank)和未知樣本的定量結(jié)果作出判讀，可避免人為錯(cuò)誤，縮小灰區(qū)，提高檢出率。

ddPCR獨(dú)有的微滴處理技術(shù)，使其對(duì)PCR擴(kuò)增效率的變化不再敏感，不懼含有PCR抑制物樣本的挑戰(zhàn)。隨著疫情的變化以及流行病學(xué)調(diào)研的推進(jìn)，更多類型的檢測(cè)乃至環(huán)境監(jiān)測(cè)也可能需要進(jìn)行，ddPCR的這一優(yōu)勢(shì)會(huì)發(fā)揮作用。此外，如果新型冠狀病毒發(fā)生變異，病毒基因序列上引物、探針靶向位置出現(xiàn)SNV，ddPCR亦能克服引物、探針結(jié)合能力下降帶來(lái)的擴(kuò)增效率變化，確保穩(wěn)定檢出。不僅如此，還能根據(jù)樣本微滴熒光信號(hào)的變化，發(fā)現(xiàn)引物探針靶標(biāo)區(qū)域可能出現(xiàn)變異的病例，為NGS測(cè)序分析病毒變異提供樣本，助力流行病學(xué)研究。

應(yīng)用如下

2019- nCoV病毒檢測(cè)方法

疑似病人的快速取樣和檢測(cè)是防止疫情擴(kuò)散的當(dāng)務(wù)之急。目前新型冠狀病毒的診斷，是在符合疑似病例標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對(duì)痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等樣本進(jìn)行熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所推薦選用針對(duì)新型冠狀病毒的開放讀碼框1ab（open reading frame, ORF1ab）、核殼蛋白（nucleoprotein，N）基因區(qū)域的引物和探針序列：

Target 1（ORF1ab）:

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA

熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

Target 2（N）:

正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3'

在熒光定量PCR上的結(jié)果判斷：

陰性:無(wú)Ct值或Ct為40；

陽(yáng)性：Ct值<37，可報(bào)告為陽(yáng)性；

可疑：Ct值在37-40之間，建議重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若重做結(jié)果Ct值<40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽(yáng)性,否則為陰性。

數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)，建議采用官方機(jī)構(gòu)推薦的引物、探針序列，結(jié)合Bio-Rad ddPCR RNA一步法預(yù)混液，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件后使用。實(shí)驗(yàn)步驟如下圖：