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一、普通PCR技術(shù)

KARY MULLIS （1944.12.28-2019.8.7）

Kary Mullis于1983年發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（polymerase chain reaction ，PCR），據(jù)說(shuō)是載著女友開(kāi)車(chē)的時(shí)候，忽然靈光一閃，想到了PCR原理（論開(kāi)車(chē)的好處）。Kary Mullis于1993 年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。《紐約時(shí)報(bào)》如此評(píng)價(jià)：" 具有高度原創(chuàng)性和重大意義，幾乎將生物學(xué)分為 PCR 前和 PCR 后兩個(gè)時(shí)代。

PCR的原理：在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA。

普通PCR的優(yōu)點(diǎn)

經(jīng)典方法，國(guó)際和國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)齊全

儀器試劑成本較低

PCR產(chǎn)物可以回收后做其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

普通PCR的缺點(diǎn)

容易污染

操作繁瑣

只能定性分析

敏感性中等

存在非特異性擴(kuò)增，當(dāng)非特異條帶與目的條帶大小一樣時(shí)無(wú)法區(qū)分

基于毛細(xì)管電泳的PCR

針對(duì)普通PCR的缺點(diǎn)，一些廠家推出了基于毛細(xì)管電泳原理的儀器，將PCR擴(kuò)增后電泳的步驟在毛細(xì)管中完成，靈敏度更高，可以區(qū)分幾個(gè)堿基的差異并且通過(guò)MAERKER可以計(jì)算出擴(kuò)增產(chǎn)物的含量。缺陷是仍然需要將PCR產(chǎn)物打開(kāi)后放入儀器，仍然存在很大的污染風(fēng)險(xiǎn)。

二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR ，qPCR）技術(shù)

熒光定量PCR也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。熒光定量PCR的發(fā)展史是一部ABI、羅氏和伯樂(lè)等巨頭的蕩氣回腸的斗爭(zhēng)史，感興趣的可以去查查。該技術(shù)是目前最成熟，使用最廣泛的半定量PCR技術(shù)。

熒光染料法（SYBR Green I）：

SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green 發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光增加1000倍。所以，一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號(hào)與出現(xiàn)的雙鏈DNA量呈比列，且會(huì)隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加。由于染料是與雙鏈DNA的非特異性結(jié)合，因此可能產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。

熒光探針?lè)ǎ═aqman 技術(shù)）：

PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對(duì)引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一直線(xiàn)型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，檢測(cè)不到熒光信號(hào)；PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段），Taq 酶的 5' —— 3' 切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步。臨床檢測(cè)中Taqman探針?lè)ㄊ亲畛Ｓ玫臋z測(cè)方法。

qPCR的優(yōu)點(diǎn)

方法成熟，配套儀器試劑齊全

試劑成本中等

操作簡(jiǎn)單

檢測(cè)敏感性高，特異性高

qPCR的缺點(diǎn)

1.目的基因發(fā)生突變導(dǎo)致漏檢

2.低濃度模板檢測(cè)結(jié)果無(wú)法確定

3.使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)誤差較大。

三、數(shù)字PCR（digital PCR ，dPCR）技術(shù)

數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于qPCR，數(shù)字PCR能夠直接讀出DNA/RNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品核酸分子的絕對(duì)定量。1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler正式提出了dPCR的概念。

2006年，F(xiàn)luidigm公司第一個(gè)生產(chǎn)商業(yè)化的基于芯片的dPCR儀。2009年，Life Technologies推出了OpenArray和QuantStudio 12K Flex dPCR系統(tǒng)，2013年，Life Technologies又 推 出 了QuantStudio 3DdPCR系統(tǒng)，采用高密度的納升級(jí)微流控芯片技術(shù)，將樣本均勻的分配至20 000個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)孔中。

2011年，Bio-Rad公司推出了基于微滴的QX100 dPCR儀，利用油包水技術(shù)，將樣品平均分配到20 000個(gè)微滴油包水中，利用微滴分析儀對(duì)微滴進(jìn)行分析。2012年RainDance公司推出了RainDrop dPCR儀，在高壓氣體驅(qū)動(dòng)下，將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分割成包含100萬(wàn)至1 000萬(wàn)個(gè)皮升級(jí)別微滴的反應(yīng)乳液。

至此數(shù)字PCR就形成了2大派別，芯片式和微滴式。不論是哪種數(shù)字PCR，其核心原理都是有限稀釋?zhuān)K點(diǎn)PCR和泊松分布。將含有核酸模板的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系，平均分配成幾萬(wàn)個(gè)PCR反應(yīng)，分配到芯片或微滴中，使每個(gè)反應(yīng)中盡可能含有一個(gè)模板分子，進(jìn)行單分子模板PCR反應(yīng)，通過(guò)讀取熒光信號(hào)的有或無(wú)進(jìn)行計(jì)數(shù)，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)泊松分布的校準(zhǔn)進(jìn)行絕對(duì)定量。

dPCR的優(yōu)點(diǎn)

實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量

更高的敏感性和特異性

可以檢測(cè)低拷貝樣品

dPCR的缺點(diǎn)

1.儀器設(shè)備和試劑昂貴

2.操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)

3.檢測(cè)范圍較窄

目前三代的PCR技術(shù)各有各的優(yōu)缺點(diǎn)，也各有各的應(yīng)用領(lǐng)域，并不是一代取代一代的關(guān)系。技術(shù)的不斷進(jìn)步給PCR技術(shù)注入了新的活力，使其能解鎖一個(gè)又一個(gè)的應(yīng)用方向，使核酸檢測(cè)更方便、更準(zhǔn)確。