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細(xì)胞增殖檢測(cè)(MTT檢測(cè))

MTT實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)介

MTT法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)增殖的方法。

檢測(cè)原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO )能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)（或其他波長(zhǎng)）處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值(OD值)，來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)(如果是測(cè)藥物毒性，則表示藥物毒性越小)。

該方法靈敏度高、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及細(xì)胞放射敏感性測(cè)定等等。

操作方法

貼壁細(xì)胞1、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。2、5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況3、5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。7、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）

懸浮細(xì)胞1、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無(wú)血清）培養(yǎng)基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 l?g/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測(cè)物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100?(儲(chǔ)存液100 1640）。2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過(guò)步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。5、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。

結(jié)果示例

客戶提供

1、實(shí)驗(yàn)信息，包括細(xì)胞類型，細(xì)胞處理藥物和條件。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果要求等。

服務(wù)流程

1、提交項(xiàng)目課題相關(guān)需求和資料。

2、與我們的專業(yè)技術(shù)團(tuán)隊(duì)討論項(xiàng)目細(xì)節(jié)。

3、根據(jù)討論后的意見對(duì)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行修改。

4、雙方均滿意并達(dá)成一致，簽訂技術(shù)服務(wù)合同。

5、開展實(shí)驗(yàn)，按期完成合同規(guī)定的內(nèi)容。

6、結(jié)題，提供實(shí)驗(yàn)原始結(jié)果和分析結(jié)果、實(shí)驗(yàn)流程、實(shí)驗(yàn)條件等等。

我們的優(yōu)勢(shì)

1、多種細(xì)胞類型供實(shí)驗(yàn)需要，包括各種腫瘤細(xì)胞系，基因敲除細(xì)胞等等。

2、專業(yè)的操作人員。

3、高規(guī)格實(shí)驗(yàn)室。

4、數(shù)據(jù)結(jié)果交付周期快。

咨詢與訂購(gòu)

感謝您選擇我們的服務(wù)，如果您有任何問(wèn)題，請(qǐng)聯(lián)系我們，我們將竭誠(chéng)為您解答和服務(wù)。

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