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Trimmer-2 cDNA normalization kit原理： 在真核細(xì)胞中，各種mRNA以不同豐度構(gòu)成了總RNA的1%。一般來說，5-10個高豐度表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄在單個細(xì)胞中可達(dá)到幾千個拷貝，占mRNA的20%，500-2000個中等豐度表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄在單個細(xì)胞中有幾百個拷貝，占mRNA的40-60%；而剩下20-40%的mRNA則是由一到幾十個拷貝的低豐度轉(zhuǎn)錄本組成。這種基因轉(zhuǎn)錄水平上的巨大差異使大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄分析復(fù)雜化，導(dǎo)致多豐度cDNA的重復(fù)測序，給文庫的篩選和分析帶來障礙。 cDNA的均一化降低了高拷貝基因的豐度，使在cDNA樣本中的基因濃度趨于一致，因此可以大大提高測序的效率和發(fā)現(xiàn)極低豐度基因的能力。 利用Duplex-Specific Nuclease（DSN）進(jìn)行cDNA均一化是一種可應(yīng)用于全長豐富的cDNA均一化的高效方法。此方法基于核酸雜交動力學(xué)和雙鏈DNA特異的DSN酶的獨特特性。DSN是來自紅金蟹的一種特異性核酸酶，具有熱穩(wěn)定性，在60-65℃時具有最大活力，即使在70℃高溫孵育20min后仍然具有25%的活力，正是由于DSN的熱穩(wěn)定性，在cDNA復(fù)性條件下dsDNA降解，可以防止二級結(jié)構(gòu)和sscDNA片段里的adapter sequences非特異性雜交的形成。復(fù)性過程中，高豐度基因更頻繁地轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈的cDNA。這樣，就明確地形成了兩部分：高風(fēng)度的cDNA部分和均一化的單鏈cDNA，接著雙鏈cDNA被DSN降解；ss cDNA可經(jīng)PCR放大，對PCR引物和條件進(jìn)行了優(yōu)化，減少對更短片段的擴增趨勢。 可進(jìn)行均一化的cDNA的制備應(yīng)該基于總RNA或者poly（A）+RNA，并且在兩端應(yīng)該含有已知的adapter sequences以用于PCR擴增。對于構(gòu)建全長cDNA文庫來說，RNA的質(zhì)量是至關(guān)重要的。在cDNA合成過程中，可用多種方法在cDNA末端引入側(cè)翼序列，如：adapter連接和模板交換法。 利用DSN均一化已成功用于多種動物和植物模型，這種靈活的均一化方法稍加修改即可應(yīng)用于多種用途。應(yīng)用： DNAnormalization技術(shù)是一種新型的高效平衡化未克隆的全長富集cDNA的有效方法。Trimmer-2試劑盒是Evrogen公司獨有產(chǎn)品，利用DNAnormalization技術(shù)，高效降低高豐度表達(dá)基因、富集低豐度表達(dá)基因，得到的cDNA包含相等濃度的不同基因，可應(yīng)用于cDNA文庫的構(gòu)建和直接測序，以及在后續(xù)的測序平臺Illumina/Solexa、ABI/ SOLiD和Roche / 454上的高通量測序。另外，這個試劑盒還與構(gòu)建cDNA的ClontechSMART-based kit兼容，來用于cDNA均一化。特點：1、快速有效地降低在文庫中高拷貝存在的cDNA 的豐度2、克隆文庫前對全長豐富的cDNA進(jìn)行均一化3、操作簡單，無需物理分離步驟4、與Illumina /Solexa,，ABI / SOLiD和Roche / 454的測序?qū)嶒炌耆嗳? 溫馨提示：不可用于臨床治療。