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品牌: genelb 公司: 上海晶萊生物技術(shù)有限公司

提供商： 晶萊生物 服務(wù)名稱： 凝膠遷移或電泳遷移率EMSA實(shí)驗(yàn) 規(guī)格： 凝膠遷移或電泳遷移率EMSA實(shí)驗(yàn)

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【晶萊生物】凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測(cè) 如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白時(shí)，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異）， 和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競(jìng)爭(zhēng)的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。實(shí)驗(yàn)步驟1. 探針的標(biāo)記探針為含有與蛋白特異結(jié)合的中心盒，大約20 bp左右，使用pierce公司的3’末端標(biāo)記試劑盒(PIERCE，Rockford，IL，USA)標(biāo)記。操作步驟參照說明書，具體步驟如下： 1) 將試劑盒中除TdT以外的其他組分解凍并置于冰上。迅速稀釋TdT：Sx TdT Reaction Buffer 2 u1，超純水7 ul 20 U/ul TdT 1 ul。稀釋后得到1 Xdiluted TdT(2 U/ul)，稀釋后的TdT必須現(xiàn)配現(xiàn)用，稀釋后不能保存。 2) 反應(yīng)體系：5x TdT buffer 10 ul，DNA 5 pmol，Biotin-ll-UTP 5 ul，diluted TdT5 ul，超純水補(bǔ)足50 ul。在37℃溫浴30 min，加入2/5體積0.2 M EDTA，終止反應(yīng)。加入等體積氯0仿：異戊醇(24：1)抽提TdT，渦懸充分，高速離心3 min，取上層即為標(biāo)記探針，分裝后-80℃保存。2. 非變性電泳 1) 非變性電泳：30%丙稀酸胺2.66 ml，TBE(5X)2 ml，10%過硫酸按1.4 ml，TEMED7 ul，雙蒸水補(bǔ)足20 ml。按照上述配方配置4%的非變性膠。在燒杯中迅速混勻，置于冰上，灌膠，待凝膠聚合后拔出梳子，用雙蒸水洗點(diǎn)樣孔，再用0.5xTBE清洗點(diǎn)樣孔。 2) 樣品準(zhǔn)備：按照不同的組合加入DNA和蛋白，另外還需要加入結(jié)合緩沖液，如果是粗蛋白還需要加入poly(dI.dC)(試劑盒中有)抑制非特異性條帶的產(chǎn)生。 3) 電泳：預(yù)跑膠30-60 min，100 V。上樣。跑膠，100 V，30 min左右。注意電泳要在冰上完成，以防止電泳時(shí)產(chǎn)生熱量使不穩(wěn)定的復(fù)合物解離。 4) 轉(zhuǎn)膜：電泳跑好后，將膠取下，放在大小相似的尼龍膜上，上下各加一層潤(rùn)濕的blotting paper，放到半干轉(zhuǎn)移裝置上，100 V，380 mA，轉(zhuǎn)膜1 h。 5) UV交聯(lián)：取出膜。在紫外交聯(lián)儀中999.9 mJ，固定10 min。 6) 洗膜： a. 將Blocking Buffer和4XWash Buffer置于37-50℃使其溶解。 b. 用20 ml of Blocking Buffer封閉膜，溫浴15 min，搖床輕搖。 c. 在20 ml Blocking Buffer中加入66.7 ul Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate(1：300稀釋)，配置成conjugate/blocking solution。 d. 將膜從blocking buffer中取出，在conjugate/blocking solution中輕搖15 min。 e. 將4XWash Buffer用雙蒸水稀釋成1 Xwash solution。 f. 將膜置于新的培養(yǎng)皿，用20 ml 1 Xwash solution沖洗。 g. 用1 Xwash solution洗膜4次，每次5 min，搖床輕搖。 h.在新培養(yǎng)皿中加入30 ml Substrate Equilibration Buffer，將膜放入，溫浴5 min，搖床輕搖。 i. 將6 ml Luminol/Enhancer Solution和6 ml Stable Peroxide Solution避光置于錫箔紙包好的燒杯中，搖勻，作為Substrate Working Solution。 j. 將膜從Substrate Equilibration Buffer中取出，用濾紙盡量吸去液體，放入新的培養(yǎng)皿。 k. 將Substrate Working Solution用槍慢慢加到膜上使液體盡量到達(dá)整張膜，靜置5min。 l. 取出膜，控制膜不能干燥。 m. 用保鮮膜將膜包好，不能有氣泡。 n. 在暗室中，將膜放入曝光盒，用X-ray膠片壓片，曝光時(shí)間隨溫度變化而不同，室溫一般1 min。然后將膠片取出，經(jīng)過顯影，水洗和定影可以看到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果膠片長(zhǎng)期保存一定要在水龍頭底下長(zhǎng)時(shí)間沖洗，晾干后可拍照。客戶提供：1、客戶提供組織、細(xì)胞，公司提取核蛋白并進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定；2、客戶提供核蛋白，公司進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定；3、客戶提供已知濃度的核蛋白，公司進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)。我們將為您提供：樣品質(zhì)檢報(bào)告、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析、實(shí)驗(yàn)方法及樣品EMSA電泳圖。收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果：歡迎咨詢?cè)斦劊覀儠?huì)根據(jù)您的方案及需求制定詳細(xì)的服務(wù)協(xié)議。更多實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)請(qǐng)瀏覽網(wǎng)站其他內(nèi)容，或來電咨詢！做實(shí)驗(yàn)，找晶萊！您的科研生涯，我們一路相伴！【平臺(tái)項(xiàng)目開展范圍】慢病毒，腺病毒，RNAi類，分子生物實(shí)驗(yàn)，病理實(shí)驗(yàn)，免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)，芯片類實(shí)驗(yàn)，并為廣大客戶朋友們提供課題設(shè)計(jì)指導(dǎo)、基金申請(qǐng)指導(dǎo)、SCI、核心期刊等服務(wù)。全國統(tǒng)一咨詢服務(wù)熱線:4008-766-085【上海公司】上海市嘉定區(qū)槎溪路788弄1號(hào)17層【北京公司】北京市大興區(qū)科創(chuàng)十四街嘉捷·BDA企業(yè)匯16號(hào)樓三層【長(zhǎng)沙公司】長(zhǎng)沙市高新區(qū)麓谷大道627號(hào)新長(zhǎng)海中心B2-403室 【技術(shù)咨詢】18500539084【公司郵箱】lab-china@genelb.cn【全國業(yè)務(wù)咨詢】北京：18810244671 上海：15800916241 長(zhǎng)沙：15616228964 武漢：15201856307 西安：13651049420 廣州：18810244571 其他地區(qū)：13818286017【晶萊生物】已開展了數(shù)千個(gè)實(shí)驗(yàn)外包項(xiàng)目。我們專注于醫(yī)學(xué)課題研究，已從課題申請(qǐng)、方案設(shè)計(jì)、試劑采購、模型構(gòu)造、標(biāo)本檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析、以及對(duì)SCI撰寫與發(fā)表的支持，各個(gè)環(huán)節(jié)積累了數(shù)千個(gè)成功案例經(jīng)驗(yàn)，為數(shù)千個(gè)來自臨床的科研工作者解決了大量的科研問題。更多相關(guān)實(shí)驗(yàn)服務(wù)信息請(qǐng)咨詢晶萊生物