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品牌: shyijisy 公司: 上海一基實(shí)業(yè)有限公司

貨號： YJ011202 L 供應(yīng)商： 上海一基實(shí)業(yè)有限公司 數(shù)量： 100

產(chǎn)品詳情請聯(lián)系金山科研平臺微信：jinshanbio
致病微生物系列致瀉大腸埃希氏菌鑒定劑盒（PCR法）產(chǎn)品說明致瀉大腸埃希氏菌鑒定劑盒參照《GB4789.6—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行設(shè)計(jì)，可針對食品樣品中的致瀉大腸埃希氏菌特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過電泳判斷樣品的鑒定結(jié)果。該產(chǎn)品檢出限為10^3 cfu/ml（使用旋達(dá)071021M細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取1 ml 10^3cfu/ml增菌液的細(xì)菌基因組DNA作為模板）。一管式檢測試劑為本公司研發(fā)的產(chǎn)品，與傳統(tǒng)PCR法檢測試劑具有等效的檢測性能，其中的固封液不影響檢測反應(yīng)與熒光檢測性能，并且對試劑蒸發(fā)與氣溶膠污染起到一定的防范作用。該產(chǎn)品無需分裝試劑，有效減少反復(fù)凍融及分裝過程中造成的試劑活性下降及試劑污染，無需增設(shè)試劑配置區(qū)，省時(shí)省力省空間。（該產(chǎn)品反應(yīng)液中已含熒光染料，可直接使用熒光定量PCR儀進(jìn)行定性檢測）◆產(chǎn)品組成（96測試）

試劑含量作用孔1反應(yīng)液-uidA23μl/孔12孔/排8排（本產(chǎn)品使用12聯(lián)PCR管分裝，每排含12種反應(yīng)液各23ul）內(nèi)參孔2反應(yīng)液-ipaH鑒定EIEC孔3反應(yīng)液-pic鑒定EAEC孔4反應(yīng)液-aggR鑒定EAEC孔5反應(yīng)液-astA鑒定EAEC孔6反應(yīng)液-stx1鑒定EPEC與EHEC孔7反應(yīng)液-stx2鑒定EPEC與EHEC孔8反應(yīng)液-bfpB鑒定EPEC與EHEC孔9反應(yīng)液-escV^a鑒定EPEC與EHEC孔10反應(yīng)液-lt鑒定ETEC孔11反應(yīng)液-stp鑒定ETEC孔12反應(yīng)液-sth鑒定ETECNG-Ecoli100μL × 1支陰性對照NG-DW100μL × 1支空白對照PG-Ecoli100μL × 1支陽性對照Loading Buffer600μL×1支電泳上樣緩沖液

◆所需儀器ABI ，BioRad，TaKaRa等PCR擴(kuò)增儀，電泳儀，凝膠成像儀等電泳配套設(shè)備。（使用熒光定量PCR儀進(jìn)行定性判讀時(shí)則無需電泳設(shè)備）◆自備耗材和儀器①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②冰盒；③移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；④離心機(jī)；⑤渦旋混勻器；⑥金屬浴。◆樣品處理參照《GB4789.6—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》中的操作步驟進(jìn)行前增菌。建議使用試劑配套細(xì)菌基因組DNA提取系列產(chǎn)品。◆實(shí)驗(yàn)操作1．添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）取所待檢樣品數(shù)+3的12聯(lián)反應(yīng)管，將試劑完全解凍，分離心30s。離心后揭開封口膜，使用穿刺加樣法穿過固封層向每管反應(yīng)液中分別加入2μL模板（或直接使用無菌吸頭挑取少許待檢菌落至反應(yīng)管中）。加樣示例：（有2個(gè)待測樣品）取5排12聯(lián)反應(yīng)管，按順序第一排全部加NG-DW，第二排全部加NG-Ecoli，第三排全部加樣品1，第四排全部加樣品2，第五排全部加PG-Ecoli。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。2. 擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：（如需使用熒光法進(jìn)行檢測請選擇FAM通道）

PCR循環(huán)熒光收集位點(diǎn)95℃10分鐘1個(gè)循環(huán)—95℃30秒30個(gè)循環(huán)—63℃30秒—72℃90秒※72℃5分鐘1個(gè)循環(huán)—

3. 產(chǎn)物電泳（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）稱量4. 0g瓊脂糖粉，加入至200 mL的1×TAE電泳緩沖液中，充分混勻。使用微波爐反復(fù)加熱至沸騰，直到瓊脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待瓊脂糖溶液冷卻至60℃左右時(shí)，加入溴化乙錠( EB )至終濃度為0.5μg/mL，充分混勻后，輕輕倒入已放置好梳子的模具中，凝膠長度要大于10cm，厚度宜為3mm~5mm。檢查梳齒下或梳齒間有無氣泡，用一次性吸頭小心排掉瓊脂糖凝膠中的氣泡。當(dāng)瓊脂糖凝膠完全凝結(jié)硬化后,輕輕拔出梳子，小心將膠塊和膠床放入電泳槽中，樣品孔放置在陰極端。向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液，液面高于膠面1mm~2mm。將 5μLPCR產(chǎn)物與1μL6×上樣緩沖液混勻后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下膠孔，小心上樣于孔中；陽性對照的 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物加入到最后一個(gè)泳道;第一個(gè)泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通電泳儀電源，根據(jù)公式：電壓=電泳槽正負(fù)極間的距離（cm）×5V/cm計(jì)算并設(shè)定電泳儀電壓數(shù)值；啟動電壓開關(guān)，電泳開始以正負(fù)極鉑金絲出現(xiàn)氣泡為準(zhǔn)。電泳30min~45min后，切斷電源。取出凝膠放入凝膠成像儀中觀察結(jié)果，拍照并記錄數(shù)據(jù)。

可使用Gold view、Gal-Rad等等效的核酸熒光染料替代EB。推薦使用DNA Marker：DL2000或100bp ladder，等可指示100bp~1500bp條帶的Marker。

結(jié)果分析

陰陽性判讀：

進(jìn)行電泳檢測時(shí)，需對比Marker進(jìn)行判斷，當(dāng)目的靶標(biāo)對應(yīng)位置出現(xiàn)單一顯著條帶時(shí)可判斷該靶標(biāo)為陽性；否則為該靶標(biāo)檢測為陰性。（使用熒光定量PCR儀檢測時(shí)，檢測孔Ct≤30時(shí)判斷該孔為陽性；當(dāng)檢測孔Ct＞30時(shí)，該檢測孔為陰性）示例電泳圖

有效性判讀：

需同時(shí)滿足：1.空白對照中所有泳道均為陰性；2.陰性對照中uidA泳道陽性，其余泳道陰性；2.陽性對照中所有泳道陽性，此時(shí)可判斷實(shí)驗(yàn)有效。如無法滿足上述條件，則實(shí)驗(yàn)無效，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)；如重復(fù)后結(jié)果仍為無效，請于本公司技術(shù)支持聯(lián)系。

結(jié)果判讀：

在實(shí)驗(yàn)有效的情況下，可根據(jù)下表進(jìn)行判讀：

致瀉大腸埃希氏菌類別目標(biāo)條帶的種類組合EIECipaH（＋）uidA（＋／－）EAECaggR，astA，pic中一條或一條以上陽性EPECbfpB（＋／－），eae（＋），stx1（－）stx2，（－）STEC/EHECstx1，stx2中一條或一條以上陽性，eae（＋／－），bfpB（－）ETEClt，stp，sth中一條或以上陽性

97%以上大腸埃希氏菌為uidA陽性，可參考陰性對照中該基因檢測結(jié)果判斷擴(kuò)增效果；當(dāng)結(jié)果判定為EPEC陽性時(shí)，若bfpB靶標(biāo)為陽性則說明樣品含有典型EPEC；若bfpB靶標(biāo)為陰性則說明樣品為非典型EPEC；當(dāng)結(jié)果判定為STEC/EHEC陽性時(shí)，若eae靶標(biāo)為陽性則說明樣品含有典型EHEC；若eae靶標(biāo)為陰性則說明樣品為非典型EHEC。

◆注意事項(xiàng)1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。2）第二區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。 ★分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。2. 實(shí)驗(yàn)過程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗(yàn)產(chǎn)生的所有廢棄物及時(shí)處理。3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步